蛍光顕微鏡とは
オレンジサイエンスは、ライフサイエンスの中でも細胞生物学分野に関する研究機器に特化して販売およびサポートをしている会社です。
このページでは、蛍光顕微鏡について、蛍光顕微鏡とはどんな研究機器かをご説明し、当社が扱う蛍光顕微鏡ライブセルイメージングシステム「Lumascope」を例に、蛍光観察法や使い方、応用例、光源、用途、特徴、波長、仕組み、原理、メリット・デメリット、蛍光顕微鏡の原理と仕組み、フィルターについて、蛍光顕微鏡の用途や応用例、蛍光顕微鏡の使い方、実際に蛍光顕微鏡で撮影された観察画像や観察対象サンプルや細胞例、画像、動画、蛍光観察の方法について詳しくご紹介します。
蛍光顕微鏡とは
蛍光顕微鏡とは、従来使用されていた光による顕微鏡にさらに機能を追加した顕微鏡です。
従来の顕微鏡では、可視光を用いてサンプルに光を当てて拡大された画像を観察していましたが、蛍光顕微鏡は、より高強度の光源を使用し、サンプル中の蛍光種を励起させています。
この蛍光種は、より長い波長の低エネルギーの光を放出し、拡大画像を生成します。
蛍光顕微鏡は、微生物のような小さなサンプルの特徴を画像化するため、小さなスケールで3次元の特徴を視覚的に強調するためにも使用されます。
これは、蛍光タグを抗体に付着させることで実現することができ、その抗体が標的とする特徴に付着、または、染色することで実現することができます。
この種の顕微鏡法では、反射光と背景の蛍光がフィルタリングされているため、特定サンプルの観察ターゲットとなる箇所を画像化することができます。これにより、目的の器官や観察対象の表面の特徴を視覚化することができます。
共焦点蛍光顕微鏡は、サンプルの3次元的な性質を強調するために最もよく使用されます。これは、ピンポイントに集光できるレーザーなどの強力な光源を使用することで実現します。
多くの場合、画像再構成プログラムは、複数のレベルの画像データをつなぎ合わせて、対象となるサンプルの3D再構成を行います。
蛍光顕微鏡の例
蛍光顕微鏡による観察例
蛍光顕微鏡の原理と仕組み
蛍光顕微鏡の基本的な原理と機能は、励起光を試料に照射し、画像の中から弱い光を選別することです。顕微鏡にはフィルターが付いており、フィルターは蛍光物質と一致する特定の波長の放射線だけを通します。放射線は試料の原子に衝突し、電子はより高いエネルギーレベルに励起されます。そして、電子はより低いレベルまで緩和されると発光します。
観察目的のサンプルは蛍光体で標識され、その後、より高いエネルギーの光源でレンズを介して照明されます。照明光は蛍光体に吸収され、より長い低エネルギーの波長の光を放出します。この蛍光の光は、特定の波長に合わせて設計されたフィルターで周囲の放射線から分離することができ、蛍光を発している部分だけを見ることができます。
検出可能（人間の目に見える状態）になるために、サンプルから放出された蛍光は、第2のフィルターによってはるかに明るい励起光から分離されます。これは、放出された光のエネルギーが低く、照明に使用される光よりも波長が長いためです。
今日、生物学で使用されている蛍光顕微鏡のほとんどはエピ蛍光顕微鏡であり、励起と蛍光の観察の両方がサンプルの上で行われます。
蛍光顕微鏡のフィルターと波長
オレンジサイエンスが扱うLumascope蛍光顕微鏡ライブセルイメージャーの本体と内部の画像
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蛍光顕微鏡の用途・応用例
蓄光顕微鏡の改良やレーザーなどの強力な集光光源の出現により、共焦点レーザー走査型顕微鏡や全反射蛍光顕微鏡（TIRF）など、より高度な技術を持つ顕微鏡が開発されています。
CLSMは、微生物などのサンプルの表面下層の高解像度3D画像を作成するための重要なツールです。その利点は、接眼レンズで全体を見るのではなく、一点一点を撮影し、コンピュータで再構成することで、様々な深さのを持つ厚いサンプルを鮮明な画像で撮影できることです。
これらの顕微鏡は多くの場合、次のような用途や目的で使用され、細胞や身体組織などを観察する際のメリットとなっています。
蛍光顕微鏡のメリット・目的
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細胞などの小さな試料の構造成分をイメージング
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細胞集団の生存率調査を行う
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細胞内の遺伝物質のイメージング（DNAとRNA）
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FISHなどの技術を用いて、より大きな集団内の特定の細胞を観察する
参考文献
George Rice, Montana State University, Fluorescent Microscopy, from https://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/fluromic.html
蛍光顕微鏡の使い方
ここでは、蛍光顕微鏡の使い方をオレンジサイエンスが取り扱う「Lumascope」を例にご説明します。
Lumascopeはインキュベーター、安全キャビネット、環境制御ワークステーションなどの限られたスペースの中で使用できる小型蛍光顕微鏡ライブセルイメージングシステムです。
お使いのコンピューターとUSDで接続するだけで、数分でセットアップでき、即座に使用が可能です。
下記の順でセットアップを行います。
1. Lumascope本体、パソコン、ソフトウェア、対物レンズを事前に準備します。
2. Lumascope本体に対物レンズをセットし、USBケーブルでLumascope本体とパソコンを接続しソフトウェアを立ち上げます。
以上の手順で簡単にセットアップができ、観察準備が整います。
さらに詳しい蛍光顕微鏡の使い方やソフトウェアの使用方法、蛍光顕微鏡のメンテナンス方法や使い方動画、などは下記のボタンからご覧いただけます。動画やタイムラプスの作成方法、蛍光調整や画像撮影方法、複数画像の合成方法などが画像や動画で確認できます。
蛍光顕微鏡の観察画像
細胞観察分野では、個々の画像の観察キャプチャや３色蛍光、単色蛍光、位相差などの合成画像、タイムラプスシリーズ画像作成およびタイムラプスビデオへの編集、ライブビデオ録画などの画像・動画が用いられます。
鮮明な画像が簡単に記録でき、蛍光顕微鏡による細胞観察を容易にしています。
下記リンクより、Lumascopeを用いた観察例動画、画像、研究者の方々が撮影した撮影画像例をご覧いただけます。
蛍光顕微鏡の観察対象や細胞例
蛍光顕微鏡は観察対象は幅広く、身体内や動植物のあらゆる組織や細胞、核、細胞膜、細胞小器官、特定のタンパク質、細菌などの観察に用いられます。主に研究用途として用いられる細胞としては、ips細胞、心臓、血管、皮膚、筋肉、肺、腱、靭帯、軟骨、骨の細胞や骨肉腫の細胞、癌細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、血管前駆細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、幹細胞、脂肪、上皮細胞、線維芽細胞、酵母細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、リンパ球などの身体内のあらゆる細胞や組織の研究、再生医療に関する研究に用いられます。
蛍光観察とは
蛍光観察とは、観察対象物に励起光を当て、その際に対象物から発生する蛍光を観察する観察法で、蛍光イメージングとも呼ばれます。観察装置としては蛍光顕微鏡が用いられ、細胞やタンパク質などを生きたままで観察できるという特徴を持っています。ソフトウェアを活用したタイムラプス撮影や3色イメージング、やインキュベーター内での長期間に渡る観察、自動ステージ、位相差観察、USBによる電源供給ができる蛍光顕微鏡など、研究用途に応じて様々なタイプの蛍光顕微鏡が用いられます。
蛍光顕微鏡コンテンツ
オレンジサイエンスでは、蛍光顕微鏡の用語集、ライブセルイメージングについてのページ、蛍光顕微鏡に関するFAQなど、蛍光顕微鏡に関するコンテンツをご用意しております。
蛍光顕微鏡 - Lumascope
Etaluma Microscope
インキュベーター内で使用できる
３色蛍光ライブイメージング顕微鏡
エタルマのLumascope（ルマスコープ）は、優れた感度、解像度、ゼロピクセルシフトを備えた、半導体光学の新しいコンセプトで設計された、倒立型小型蛍光顕微鏡です。
そのコンセプトのデザインにより、インキュベーター、ドラフトチャンバーなどの限られたスペースの中で使用でき、幅広いラボウエアでのライブセルイメージングを可能にします。
コンパクトデザインによりインキュベーターやワークステーション内で使用可能
A Dramatic New Concept
インキュベーター内で使用できる小型蛍光顕微鏡
Lumascopesは、従来の高価な顕微鏡に匹敵する高解像度画像を備える、用途の広い、コンパクトな倒立型蛍光顕微鏡で、日々顕微鏡を使用する科学者によって考案、設計されました。従来の倒立顕微鏡は非常に高価で、複雑で、不要な機能も多く搭載していましたが、 Lumascopeは、高画質、汎用性、小型化、使いやすさ、低価格を実現しました。
LumascopesはLED光源、Semrockフィルター、最先端の光学技術、CMOSセンサーにより、回折限界に近い解像度画像（理論上）の提供を可能にします。USBでPCと接続することにより、画像、タイムラプス、動画の取り込みが非常に簡単です。そして、非常にコンパクトなので、インキュベーター、安全キャビネット、ワークステーションなどの限られたスペースでの作業が可能で、モデルにより、外部からのリモート操作、イメージモニタリングが可能です。
Lumascopesは、手動XYステージ、または自動ステージを備えており、汎用のマイクロプレート、フラスコ、ディッシュ、カスタムラボウェアに対応しています。 USBで画像をコンピュータに直接送信するLumaviewソフトウェアが付属しているため、オンボードでの画像保存、処理が不要になり、コンパクト化を実現しました。 Lumaviewは、数秒、数分、数時間、または数日にわたるタイムラプス観察を可能にし、ライブビデオは毎秒最大30フレームで録画が可能です。
BPAE cells
BPAE cells stained to show nuclei (blue), alpha-tubulin (green), and F-actin (red) on an LS 620; LifeTech FluoCells slide #2; 40x Olympus objective.
多彩なアプリケーション・汎用性
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ライブセルイメージング
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細胞増殖、コンフルエンス
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細胞移動、創傷治癒
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トランフェクション効率の決定
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タンパク質発現のトラッキング、定量化
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細胞分化観察
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含有分析
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生体内調査
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AC電源不要顕微鏡撮影
ベネフィット
LED光源とCMOSセンサーを高度な光学技術で顕微鏡に応用し、理論上最大値付近の解像度を得ています。お使いのラップトップにUSBで接続して使用し、動画やタイムラプスも取り込めます。システムを極力単純化したために、これまでの顕微鏡では考えられない丈夫な構造です。また、光源が弱くても十分な光度が得られているため、光が与える細胞への損傷や蛍光減衰が極力抑えられます。
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レンズ着脱式（1.25~100倍対応！）
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オリンパスレンズ使用可能（高画質）
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培養インキュベーター内に収まる設計
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回折限界付近の高解像度
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3色（赤、青、緑）蛍光
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位相差観察のオプション有
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自動ステージモデル有
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撮影例
マウス着床前胚発生
（LS620 対物x20（オリンパス製）で撮影）
東京大学農学生命科学研究科
応用遺伝子学研究室でLS620を採用頂きました。
エレクトロポレーション(電気穿孔法):
脂質生成間葉幹細胞のための持続可能な細胞生物学保存細胞ラベリング論
Kathrin von der Haar 氏他
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30944770
エタルーマ社のインキュベーター蛍光顕微鏡LumaScope600（40倍の対物レンズ使用）で撮影されたエレクトロポレーションをされたAD-hMSCのeGFP発現
内皮細胞はSiM Pore’s のナノ多孔性シリコン窒化物膜上で24時間以上培養されました。採取後すぐのヒトの好中球をシリコン膜の上部から灌流し、強力な化学誘引物質(fmlp)をシリコン膜の下層チャネルに加えたものです。
この位相差ビデオは、Etaluma LS560を使用し、１分間に10フレームを30分以上の間撮影したものです。二種類の色は膜の上下を示しています。
ビデオ提供:ロチェスター大学McGrath研究室 分析:DRVision Quyen Tran
コラーゲンマトリックス(3Dコラーゲン発芽アッセイ)に埋め込まれたヒトのスフェロイド黒色腫 (メラノーマ)。個々の細胞がスフェロイドから出ようとしているのが見えます。コラーゲンマトリックスへの腫瘍の浸透／運動性を測定しています。タイムラプスはインキュベーター内のLS720自動蛍光顕微鏡で撮影したものです。
提供:ドレクセル大学Ed Hartsough研究室
卵母細胞の成熟過程における殺虫剤の影響について
Xiang-Shun Cui 氏他曰く、”フィプロニルは、ブタの卵母細胞の生体内での成熟期に、アポトーシスや細胞周期の進行停止を促進します。”
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10495-019-01552-w
フィルタープロファイル
堅牢性
Lumascopeはグローバルで600台近く販売されておりますが、人為的な故障も含め、不具合はほとんど報告されておりません。
下記動画はドロップテストの様子です。通常の使用で考えられる約１ｍの高さからの落下した後でも、正常に動作しているのがお分かり頂けます。
また、通常のインキュベーター内での使用はもちろん、90度の過酷な環境化でも数日間使用できた実績もございます。
ユーザーボイス
Alex Zambon
Pharmaceutical Sciences
「タイムラプスイメージングからの定量的データにより、単一細胞の細胞シグナル伝達について、前例の無い洞察を得ることができます。 今まで、この分野の進歩の阻害要因は、従来のライブイメージングシステムのコストにありました。 しかし、LS720により、低コストで多色ライブセルレポーターからリアルタイムのデータを得ることができるようになり、単一時点で異種細胞集団にわたる平均シグナルを測定する高価なELISAベースの壊れた細胞アッセイから、経時的に単一細胞分解能で本質的に自由なデータポイントを取得することに切り替えることができました。 また、電動ステージとマルチウェルフォーマットのおかげで、もうプレートリーダーを使う必要はありません。」
R. Zucker
Neurobiology Division
「1200ピクセルのフレームサイズと20倍の対物レンズを搭載したLS 620は、標準のキセノン、ハロゲン、または白熱照明を使用した顕微鏡で見たものよりも、はるかに明るく、均一な照明を提供します。 」
Stanford University
Stary Neuroscience Lab
「Lumascopeによって、はるかに高価な顕微鏡（よく知られているメーカー製）でも不可能だった低明度の蛍光ラベリングを解決することができました！」
ソフトウェア
Lumaview
Lumaviewには、個々の画像のキャプチャ、３色蛍光や１色蛍光、位相差などの合成画像、タイムラプスシリーズおよびタイムラプスビデオへの編集、ライブビデオなど様々な機能があります。現在下記の2つのLumaviewバージョンがあります。
○Lumaview 720/600シリーズ(LS720、LS620、LS600)
○Lumaview 500/400シリーズ(LS520 / 500、LS420 / 400)
デスクトップとラップトップのどちらでも使用いただけます。動作環境はWindows 7、8、8.1、10です。各Lumaviewバージョン用のユーザーガイド（完全版）はソフトウェアのヘルプセクションをご覧ください。Lumaviewのスタートアップガイドはダウンロードページからご確認いただけます。
Lumaquant
Lumaquantは、蛍光顕微鏡や位相差顕微鏡、明視野顕微鏡で取得した2Dや2D + Timeデータセットを分析するのに非常に優れています。
最先端の画像処理アルゴリズムによって、細胞、核、粒子などの対象物の強調、検出、追跡が可能です。
新しいLumaquant 7.7には、Lumaquantのすべてバージョンの2Dレシピが搭載されています。
DRVisionの*強力なPixel Classifierを使用すると、より簡単で迅速に画像分析が可能です。
また、データを総合的に分析し、広範な形態、強度、動き、および系統の測定値にアクセスすることができます。
Calcium Oscillation
Nuclei Tracking
Wound Healing
Cell Proliferation
Cell Tracking
Particle Tracking
Phase Cell Tracking
Cell Count
蛍光顕微鏡のサイズについて
コンパクトなデザインのため、細胞培養インキュベーター、組織培養フード、および環境ワークステーション内での使用が可能です。Lumascopeの高さや奥行きに関しては、下記の画像をご確認ください。
蛍光顕微鏡FAQ
どのようなモデルがありますか？
明視野モデル（LS460)、緑蛍光モデル（LS560）、3色蛍光モデル（LS620）、3色蛍光自動ステージモデル（LS720）の4モデルがございます。
使い始めには何が必要でしょうか？
本体、操作用のPC、対物レンズが必要です。PC、対物レンズは付属しません。
インキュベーターへの設置に関して、何か準備は必要でしょうか？
必要ございません。本体へはPCからUSBケーブルで電源供給をしますので、インキュベーター前面の扉に挟んで使用可能です。
蛍光顕微鏡のデモについて
Lumascopeは無料にてデモが可能です。実際の実験環境や使用環境でお試しいただき、Lumascopeの機能や性能、使いやすさ、製品の大きさ等を事前にご確認いただけます。デモ可能な機種や貸出期間等につきましてはお問い合わせください。
論文一覧
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Publication in Laboratory Equipment – Burdg LaboratoryEquipment 2016 PDF (0.7 MB)
Article published in LaboratoryEquipment.com. Jessica Burdg, Contributing Science Writer (2016) Automated Microscopy in Hypoxic Environments: Does This Change Everything? LabEquip June, 2016, 26-27.
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Kahle et al. Lumascope Poster at Neuroscience 2010 – Kahle SocNeurosci Poster 2010 PDF (1.4 MB)
Lumascope: an Inexpensive, Compact, Sturdy USB-Based Inverted Fluorescence Microscope.
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Baker Ruskinn SCI-tive Brochure – SCI-tive Brochure_PDF (1.8 MB)
Information on the SCI-tive hypoxia workstation for low oxygen “in vivo” conditions, including their use with Lumascopes.
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Publication in JALA – Kahle et al JALA 2010 PDF (0.5 MB)
Article published in the Journal of Laboratory Automation on the development of the LumaScope. Kahle J, Levin R, Niles W, Rasnow B, Schehlein M, and Shumate C. (2010) An inexpensive simple-to-use inverted fluorescence microscope: a new tool for cellular analysis. JALA Oct 15(5):355-361.
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Publication in American Laboratory – Kahle Amer Lab 2011 PDF (0.6 MB)
Article published in American Laboratory. Kahle, J, Levin, R, Niles, W, Rasnow, B, Schehlein, M, and Shumate, C. (2011) Applications of a compart, easy-to-use inverted fluorescence microscope. Am Lab, Nov/Dec, 2011.
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Publication on Time-Lapse of Neural Stem Cells – Niles 2013 Stem Cells Handbook PDF (0.9 MB)
Niles, WD, Wakeman, DR, and Snyder, EY. (2013) Growth Dynamics of Fetal Human Neural Stem Cells. Stem Cells Handbook, Sell, S (Ed), Springer Science+Business Media, New York, 75-89.